La région autour d'Ostuni est habitée depuis l'âge de Pierre. La ville est réputée avoir été établi initialement par la Messapi, une tribu pré-classique et détruite par Hannibal pendant les guerres puniques. Il fut re-construit par les Grecs, le nom de Ostuni dérivant du grec Astu néon (« nouvelle ville »).

Limogé après la chute de l'Empire romain d'Occident, en 996 AD la ville fit partie du comté de Norman de Lecce. Au cours de cette période a commencé le développement de la ville médiévale autour du sommet de la colline de 229 m d'altitude, il a été construit un château (maintenant, il reste que des pièces du château original) et les murs de la ville avec quatre portes.[2] à partir de 1300 à 1463 it partie de la Principauté de Tarente et de 1507 (ainsi que ce qui est aujourd'hui le hameau de Villanova et Grottaglie) passa à épouse Isabella, la duchesse de Bari, de Gian Galeazzo Sforza, duc de Milan. Sous l'influence d'Isabelle, Ostuni a connu un âge d'or dans le plus large panorama de la Renaissance italienne. Dans cette période Isabella protégeaient d'humanistes et de gens de lettres, y compris l'évêque Giovanni Bovio et art. Isabella est mort en 1524 et Ostuni passé en dot à sa fille de Bona Sforza, femme-à-être de Sigismond ier de Pologne, roi de Pologne. Sous le gouvernement de Bona Sforza, Ostuni a continué à bénéficié d'un régime libéral et magnanime. En 1539, elle avait tours construites le long de tout le littoral, comme protection contre les attaques prévues aux Turcs qui contrôlaient les Balkans. Ces tours (encore existant, y compris la tour de Pozzelle, le pylône, Villanova et autres), ont été en permanence en garnison et communiquer à l'aide de balises de feu.